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C-Trap 光ピンセット蛍光顕微鏡システム

C-Trapは、一分子マニピュレーションと一分子蛍光の同時観察を可能にした世界初の装置です。高分解能の光ピンセット機能、一分子観察機能(共焦点/STED/IRM)、さらにマイクロ流路が統合され、一体型の筐体に組み込まれたことにより、既存のシステムと一線を画する高い分解能・低ドリフト性を獲得しました。

C-Trapにより、真にcorrelativeな一分子計測が可能となります。

メーカー

LUMICKS

カテゴリ

生命科学

2018年、光のモーメント利用した非常に敏感な「ピンセット」の発見により、アーサー・アシュキン博士がノーベル物理学賞を受賞しました。

強度の勾配をもつレーザーを対物レンズを通して収束すると、液中の粒子はレーザーの中心に捕捉されます。まるで光で粒子を「つまんだ」ような状態になるため、光ピンセット(optical tweezer)と呼ばれます。プラスチックやシリカの粒子にはさまざまな生体分子(タンパク質、細胞骨格繊維、DNA、RNA等)を結合させることができます。そのため、光ピンセットを使えば、これらの粒子間の生体分子に非常に小さい力を加えたり、働いている力を測定することができます。

リアルタイム一分子蛍光観察

一分子蛍光観察を行いながら粒子間に働いている力をリアルタイムに測ることによって、タンパク質の活性や結合キネティクスと複合体のメカニカルな性質を関連付けることができます。特に、カイモグラフ (Kymograph) を使うと、動的なタンパク質-DNA間やタンパク質-タンパク質間の相互作用を可視化でき、今までにない新たな視点が得られます。

上の図はラムダDNAの両端を4pNの力で引張った状態で、Atto 647N標識したTFAM (ヒトミトコンドリア転写因子A) の一分子蛍光を観察した像です。(縦軸が空間軸、横軸が時間軸)DNA鎖の特定の部分に結合していたTFAMが時間がたつに連れて移動したり脱離したりするのがわかります。
(左側はConfocal像、右側は観察中にSTEDにスイッチした像です)


分子の活性、状態、構造変化

C-Trapによって、タンパク質やDNAの特有の構造変化を検出することができます。トラップした2つの粒子間の分子内の構造変化は、両端にかかる非常に微小な張力の変化で追跡することができます。

上のプロットでは、タンパク質が主要な2つの遷移状態を行き来し、平衡状態にあることがわかります。さらに注意深く観察すると、その間にもう一つ頻度の低い中間状態を持つことがわかります。C-Trapの高感度な測定ユニットは、非常に小さく頻度の低い遷移状態もとらえることができるのです。

光ピンセット部

力検出分解能 < 0.1 pN at 100Hz
最大離脱力 > 1000 pN (直径4.5µm PSビーズ使用時)
印加する力の安定性 < 1.0 pN /分
最小ステップ移動量 < 0.5 nm
トラップ間距離分解能 < 3 Å at 100Hz
カメライメージによるビーズ追跡精度 < 3 nm at 100 Hz (同時に力学測定・蛍光測定が可能)
パワースペクトルの最大コーナー周波数 15 kHz
移動領域 50 µm x 50 µm x  35 µm (X, Y, Z)
トラップ方式 高安定性・高精度の連続波
トラップ数 1 -4
トラップ駆動

XY平面は4トラップすべて独立して移動可能。

Z位置は1+2ペア, 3+4ペアそれぞれを移動可能。


(左図) 高分解能の光ピンセットにより、4Åのステップでビーズを移動できています。

(右図) 直径1.0μmのポリスチレンビーズをトラップした時のX軸方向のブラウン運動のパワースペクトル。平均化データ(灰色)と2ステップフィットで得られたライン(赤色)


ポリスチレンビーズの間の二重鎖DNA(8.5kbp) のビーズ距離を一定に保ち、その際にかかった力およびビーズの変位を20分間に渡って記録したプロット。長時間の測定でも超低ノイズかつ超低ドリフトの結果が得られます。

蛍光顕微鏡部

共焦点分解能 回折限界により制限
STED分解能 < 35 nm
レーザースポット位置精度 < 1 nm
Localiztion精度 < 15 nm
最大スキャン速度 200 Hz
蛍光検出感度 1分子蛍光に最適化
ダークカウント < 0.3 光子/ピクセル (100 s)
バックグラウンド排除制限 100 nM (積分時間1 msあたり)
撮像範囲(FoV)  50 µm x  35 µm (X,Y)
共焦点での波長 488nmから647nmの間で10種類の波長のうち、最大3波長まで装備可能
STEDでの波長 最大2波長

一分子蛍光観察と光ピンセットによる力検出は完全にCorrelativeです。

DNA引き延ばしとCas9オフターゲットへの結合

CRISPR/Cas9はゲノム編集のための強力なツールです。しかし、誤ったオフターゲット編集が治療への応用の足かせとなっています。どうやってCRISPR/Cas9がターゲットを認識しているかを理解するために、光ピンセットC-Trapを用いてCRISPR/Cas9系ではたらくタンパク質やRNAとの相互作用が観察されました。

DNAをまっすぐ引き延ばすと、蛍光分子がいつどこに結合したかがわかります。さらに一分子同士のFRET(smFRET)で観察することによって、DNA上での複合体の形成をリアルタイムに観察することができます。


ビメンチン中間径フィラメントの負荷速度に依存する力学応答

真核細胞の主要な機械的は、さまざまなタンパク質によって形成される繊維構造による細胞骨格によって特徴づけられています。筆者らは、ビメンチンを両端から引き延ばす際に、どのような力学応答があるかを光ピンセットで測定しました。その結果、負荷をかける速度(loading rate)に依存していました。そのため、細胞に加わる速く大きな変形から守っているのではないかという仮説を立てています。


非相同末端結合に関わるDNA結合タンパク質の解析

DNAの修復方法の一つである、非相同末端結合には、XLF, XRCC4タンパク質が関わっています。

C-Trapを用いた一分子リアルタイム観察で、XLFがXRCC4のDNAへの結合を促進することや、複合体形成後にDNA鎖上で速い拡散を始めることがわかりました。さらに、4トラップを使って、XRCC4-XLF複合体が2本の2重鎖DNA間同士の相互作用、いわゆるDNA-ブリッジングの役割を果たしていることが分かりました。


HPS70のシャペロン機能の新しいメカニズムの発見

HSP70をはじめとしたタンパク質-シャペロンシステムは細胞制御機能を担っています。それはタンパク質のフォールディングを助けたり、望まれない凝集を防いだり、タンパク質の輸送、さらに酵素活性の制御など、多岐にわたります。これらの機能の多さと構造を相関づけることはこれまで難しく、HSP70はフォールドする前のポリペプチド鎖と結合すると考えられてきました。Sander Tanらは光ピンセットによる力学測定によって、DnaKとして知られるバクテリアのHsp70ホモログが、「溝」によってフォールドされていないポリペプチド鎖を結合し、「蓋」とATP加水分解による構造変化によってフォールドされたタンパク質にも結合することを明らかにしました。


動画

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