MINFLUX

MINFLUXは、これまでの超解像顕微鏡技術をさらに上回る分解能、2nmを達成した、現在最も分解能の高い光学顕微鏡です。MINFLUXは、2014年にSTED顕微鏡でノーベル化学賞を受賞したステファン・ヘル博士が新たに開発した技術をもとに製品化されました。

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MINFLUXのもっとも特徴的な原理は、「蛍光のない位置を特定する」という点です。MINFLUXは蛍光一分子付近をドーナツ状の励起光で精確にスキャンし、蛍光一分子が励起されない位置を探します。この探索を広い範囲で繰り返して行うことで、蛍光分子がどこに局在しているかを決定していきます。

一分子の局在を推定する点ではPALM/STORM、ドーナツ状やカゴ状の形状の光を利用する点ではSTEDに似ているといえるかもしれません。しかし、分解能を向上させるために、既存のPALM/STORMのようにより多くの撮像（光子）を必要とせず、また、STEDのようにより強いレーザー光を用いる必要もありません。

少ない光子で最高の分解能を得るのが、MINFLUXといえます。

このようなMINFLUXイメージングは、三次元的なレーザー光の形状生成、EODやEO-Lensといった素子を用いた高精度スキャナ、振動をキャンセルするアクティブ制振など、Abberior Insturmentsの最先端のオプティクスやエレクトロニクス技術により製品化されました。

仕様

✔2D MINFLUX イメージング（分解能 2nm×2nm）

✔3D MINFLUX イメージング（分解能 3nm×3nm×3nm）

✔全自動アライメント

✔超高速スキャニング (>100kHz)、ポジショニングが可能

✔極限に少ない光子数 (<20) で検出

✔単一蛍光マーカーに対し、最大10kHzでトラッキングが可能

✔一回の局在化に要する時間は100µs、高速3D イメージングを実現

核膜孔タンパク質

核膜孔タンパク質Nuc96を染色した蛍光像

核膜孔タンパク質Nuc96は、核膜中に環状の複合体を形成するタンパク質です。ここで示す3つの画像は、左から共焦点像、STED像、そしてMINFLUX像です。

confocal像では光の回折限界によって、直径120nmの複合体を観察するために分解能が不足していることがわかります。STED像では回折限界を超えた超解像となり、ひとつひとつの複合体の位置は明確で、サブユニットの分布も可視化されます。

MINFLUXではSTEDをさらに上回る分解能で、サブユニットひとつひとつが完全に分けられていることがわかります。位置精度が2nm以下になると、どのサブユニットに蛍光色素が存在するのかが明確に判別できています。

核膜孔タンパク質　Nup96-SNAP

左と中の図は、核膜孔タンパク質Nup96にSNAPタグを介してAlexaFlour647でラベルしたMINFLUX像です。MINFLUXは多色撮像も可能で、右の図は核膜孔のWGAをCF680でラベルしたものです（図中、青）。核膜の内側だけにWGAがあることが明確に分かります。蛍光色素が複合体のどこに位置しているか、さらに膜の内側なのか外側なのかといった位置精度は、他の超解像技術では達することができません。

3D-MINFLUX

MINFLUXは、三次元でも同等の分解能で蛍光分子の局在化を検出できます。染色した核膜孔タンパク質複合体の3D-MINFLUX像では、蛍光分子が核膜を挟んで表と裏に存在することがわかります。他の超解像顕微鏡では明らかにできない分解能です。

スペクトリンの微細構造

スペクトリンの微細構造 (3D-MINFLUX)

Alexa647 で染色したスペクトリンの共焦点像とMINFLUX像です。スペクトリンの微細な縞構造は他の超解像技術よりも圧倒的なコントラストで得られています。さらに、3D-MINFLUXによって3次元的な構造もより詳細に解析が可能です。

脂質二重膜中の蛍光一分子の高速トラッキング

MINFLUXのスキャナと位置探索は高速かつ高精度です。イメージングだけでなく、蛍光一分子のトラッキングが可能です。

この図は、合成脂質の脂質二重膜中に脂質とコンジュゲートしたAtto 647N分子を分散させ、その一分子を2.9秒間トラッキングした結果です。蛍光分子のブラウン運動を逃すことなく追跡できていることが分かります。MINFLUXは、最大で10kHzの周波数で蛍光分子の位置をサンプリング可能です。